T/CI 011-2021
Lineamientos técnicos para el cultivo, observación y evaluación de la resistencia a medicamentos de biopelículas bacterianas. (Versión en inglés)

Estándar No.

T/CI 011-2021

Idiomas

Chino, Disponible en inglés

Fecha de publicación

2021

Organización

Group Standards of the People's Republic of China

Estado

ser reemplazado 2022-03

Remplazado por

T/CI 011-2022

Ultima versión

T/CI 011-2023

Alcance

Métodos de cultivo de biopelículas bacterianas y estándares técnicos Los siguientes métodos de cultivo de biopelículas y estándares técnicos están escritos con Pseudomonas aeruginosa como cepa modelo. El cultivo y las condiciones experimentales de otras especies bacterianas se pueden ajustar adecuadamente según las necesidades. Pseudomonas aeruginosa es un patógeno oportunista gramnegativo común que se distribuye ampliamente en la piel, el tracto respiratorio, los intestinos y diversos entornos naturales humanos normales, como el agua y el suelo. Esta bacteria tiene una forma flagelada única en forma de bastón y su temperatura de crecimiento adecuada es de 25 a 37 ° C. También puede crecer a 42 ° C. Aparece como una colonia redonda de color verde en el medio LB y puede adherirse fácilmente a la superficie. de diferentes sustratos para formar una biopelícula. Pseudomonas aeruginosa es una de las principales bacterias patógenas de las infecciones nosocomiales. Puede formar biopelículas en diferentes partes de los pacientes con baja inmunidad y causar infecciones crónicas a largo plazo, incluidas infecciones por quemaduras, infecciones respiratorias e infecciones del tracto urinario. También puede causar infecciones mortales. complicaciones como bacteriemia y sepsis. Esta bacteria es resistente a una variedad de antibióticos y el mecanismo de resistencia es muy complejo e incluye la formación de biopelículas, el fortalecimiento del sistema de bomba de eflujo, el cambio de la permeabilidad de la membrana celular y los objetivos de los fármacos, y la secreción de enzimas antibacterianas. El mecanismo de formación de la biopelícula de Pseudomonas aeruginosa también es bastante complejo, como por ejemplo mediante la secreción excesiva de polisacáridos extracelulares, la acumulación de ADN extracelular, la motilidad reducida y la regulación del sistema de detección de quórum. Como cepa modelo para estudiar biopelículas, Pseudomonas aeruginosa se ha utilizado ampliamente durante mucho tiempo en la investigación para construir biopelículas, detectar resistencia a los medicamentos y desarrollar regímenes farmacológicos. Esta guía está escrita con Pseudomonas aeruginosa como cepa modelo. El cultivo y las condiciones experimentales de otras cepas bacterianas se puede ajustar adecuadamente según sea necesario para lograr los mejores resultados experimentales. 4.1 Cultivo de biopelículas estáticas in vitro Esta guía cubre cuatro métodos de cultivo de biopelículas estáticas in vitro comúnmente utilizados, incluido el método de cultivo en placa de pozos, el método de cultivo en perlas de vidrio, el método de cultivo en portaobjetos y el método de cultivo con tapa de clavija. (1) Método de cultivo en placa de pocillos (4.1.1) Cultivar la solución bacteriana diluida en una placa de 96 pocillos o en una placa de 24 pocillos. La biopelícula se adhiere a la pared del pocillo. Retire la suspensión y eluya las bacterias planctónicas para obtener la biopelícula. ... en experimentos posteriores. El método de cultivo en placa de pozos se utiliza generalmente para probar la capacidad de formación de biopelículas de cepas bacterianas, la cuantificación de biopelículas, la resistencia de biopelículas y la concentración inhibidora mínima de fármacos. Este método de cultivo se puede combinar con una variedad de métodos de tinción para cuantificar biopelículas, y las estructuras de biopelículas cultivadas se pueden observar con diferentes microscopios. Este método de cultivo tiene las ventajas de un alto rendimiento, un tiempo de cultivo corto y una operación simple. Sin embargo, el espesor y la dureza de la biopelícula cultivada son bajos y las bacterias planctónicas no son fáciles de eluir, lo que resulta en grandes diferencias entre paralelos. (2) Método de cultivo de perlas de vidrio (4.1.2) Coloque las perlas de vidrio en una solución bacteriana diluida en una placa de 24 pocillos y cultívelas. La biopelícula se adhiere a la superficie de las perlas de vidrio. Las bacterias flotantes se pueden eluir para obtener el biopelícula para experimentos posteriores. Este método de cultivo es similar al método de cultivo en placa de pozos y generalmente se usa para probar la capacidad de formación de biopelículas de cepas bacterianas, la cuantificación de biopelículas, la resistencia de biopelículas y la concentración inhibidora mínima de fármacos. Este método de cultivo se puede combinar con una variedad de métodos de tinción para cuantificar biopelículas, pero no es fácil de observar con un microscopio. Este método de cultivo tiene las ventajas de un alto rendimiento y un tiempo de cultivo corto, pero la operación es un poco complicada. El espesor y la dureza de la biopelícula cultivada mediante este método son mayores, las bacterias planctónicas son más fáciles de limpiar y las diferencias entre paralelos son pequeñas. (3) Método de cultivo en portaobjetos (4.1.3) Inserte el portaobjetos en el líquido bacteriano para el cultivo y la biopelícula se adherirá a la superficie del portaobjetos. Retire el pico y eluya las bacterias planctónicas para obtener la biopelícula para experimentos posteriores. Este método se utiliza generalmente para detectar la capacidad de formación de biopelículas de cepas bacterianas y observar la estructura y morfología de las biopelículas. Puede usarse en combinación con varios métodos de tinción y varios microscopios para observar la configuración de las biopelículas. Este método tiene un alto rendimiento y un tiempo de cultivo corto, pero la operación es un poco complicada. La biopelícula cultivada mediante este método tiene una gran cantidad, alto espesor y dureza, las bacterias planctónicas son fáciles de limpiar y la diferencia entre paralelos es pequeña. (4) Método de cultivo con tapa de clavija (4.1.4) Coloque la cubierta de la placa de 96 pocillos con la cuña elevada (clavija) en la placa de 96 pocillos que contiene líquido bacteriano para cultivo. La biopelícula se adhiere a los extremos medio e inferior de la clavija. Retírela. Cubra y eluya las bacterias planctónicas en la clavija para obtener una biopelícula para experimentos posteriores. Este método es similar al método de cultivo en placa de pozos y generalmente se usa para probar la capacidad de formación de biopelículas de cepas bacterianas, la cuantificación de biopelículas, la resistencia de biopelículas y la concentración inhibidora mínima de fármacos. Este método de cultivo se puede combinar con una variedad de métodos de tinción para cuantificar la biopelícula, pero la biopelícula cultivada no es fácil de observar bajo un microscopio porque se encuentra en la parte superior de la cuña. Este método de cultivo tiene las ventajas de un alto rendimiento, un tiempo de cultivo corto y una operación simple: el espesor y la dureza de la biopelícula cultivada son mayores, las bacterias planctónicas son más fáciles de eluir y las diferencias entre paralelos son pequeñas. Los detalles de cada cultivo y método de observación se proporcionan a continuación. 4.1.1 Ámbito de aplicación del método de cultivo en placa de pocillos: El método de cultivo de biopelículas en placa de pocillos suele ser adecuado para los siguientes escenarios: (1) Es necesario detectar la capacidad de formación de biopelículas entre diferentes cepas (cepas silvestres y cepas mutantes) , (2) Es necesario detectar la sensibilidad/tolerancia de diferentes cepas a fármacos en estado de biopelícula. Los métodos de análisis de biopelículas cultivadas en placas de pocillos incluyen principalmente: cuantificación de biopelículas (Capítulo 5.1.2a), resistencia de biopelículas y concentración inhibidora mínima de fármacos (Capítulo 6.1). Los siguientes dispositivos y operaciones esquemáticos se ejemplifican utilizando Pseudomonas aeruginosa (PA) como cepa modelo y en condiciones de cultivo aeróbico: Figura 1. Método de cultivo estático de biopelículas in vitro (método de cultivo en placa de pocillos) 4.1.1.1 Materiales experimentales: a . Placa estéril de 96 pocillos (o placa de 24 pocillos, Nest/Corning); b. Depósito de líquido estéril; c. Pipeta de 100 μl (o pipeta de 1 ml); d. Tubo de agitación estéril de 15 ml; e.100 μl (o Punta de pipeta de 1 ml; f. Medio LB (se puede presionar Se necesitan otros medios); g. Cepas requeridas; h. Balde de desechos; i. Alcohol al 75%; j. ddH2O estéril; k. Solución salina fisiológica estéril. 4.1.1.2 Pasos de cultivo [El apéndice se explica en detalle en protocolo/modo SOP] Primero, inocular la cepa objetivo en medio LB y cultivarla durante la noche. En la mesa de operaciones estéril, use medio de cultivo nuevo para diluir la solución bacteriana de acuerdo con una proporción determinada, luego vierta la solución bacteriana diluida en el depósito estéril y luego use una pipeta para agregar la solución bacteriana diluida a una placa de 96 pocillos o Placa de 24 pocillos en los pocillos de la placa y colocar a la temperatura deseada para cultivar la biopelícula. Las cepas experimentales y las cepas de control se inocularon y cultivaron de acuerdo con los procedimientos de cultivo del Apéndice Xa (Apéndice Xa), y luego se analizó la biopelícula (Capítulo 5). 4.1.1.3 Puntos técnicos a.Todas las operaciones deben cumplir estrictamente con los procedimientos operativos asépticos.Durante la operación, prestar atención al uso de equipos de esterilización y utilizar alcohol para desinfectar la mesa de operaciones y los equipos utilizados para evitar la contaminación cruzada; b. Antes de agregar la solución bacteriana a la placa del pozo, agite suavemente el depósito de líquido para mezclar la solución bacteriana de manera uniforme y use una pistola de volea para soplar suavemente la solución bacteriana repetidamente para reducir los errores experimentales; c. Al cultivar biopelículas en el pozo placas, asegúrese de que los pocillos estén llenos con El volumen del líquido bacteriano restante es básicamente el mismo. Durante el cultivo, la placa de pocillos debe sellarse con una película selladora transpirable para evitar que el líquido se evapore; d. Al retirar el líquido residual y al limpiar la biopelícula, tenga cuidado de no tocar la biopelícula con la punta del tubo para garantizar la integridad de la biopelícula. 4.1.2 Ámbito de aplicación del método de cultivo de biopelículas con perlas de vidrio: El método de cultivo de biopelículas con perlas de vidrio suele ser adecuado para los siguientes escenarios: (1) Se utiliza para el cultivo cíclico de biopelículas para experimentos de evolución en condiciones de presión, (2) Es necesario detectar los efectos de diferentes cepas sobre biopelículas en estado de biopelícula Sensibilidad/tolerancia a fármacos. El principal método de análisis de biopelículas cultivadas en perlas de vidrio es: método de recuento de UFC (Capítulo 5.3.2b). Los siguientes dispositivos y operaciones esquemáticos se realizan utilizando Pseudomonas aeruginosa (PA) como cepa modelo y en condiciones de cultivo aeróbico: Figura 2. Método de cultivo estático de biopelículas in vitro (método de cultivo en perlas de vidrio) 4.1.2.1 Materiales experimentales: a. Estéril Placa de 24 pocillos; b. Depósito de líquido estéril; c. Pipeta de 1 ml d. Tubo de agitación estéril de 15 ml; e. Punta de pipeta de 1 ml; f. Medio LB (se pueden utilizar otros medios según sea necesario) ); g. ddH2O estéril (se puede utilizar solución PBS o solución salina fisiológica según sea necesario); h.  cepa requerida; i. cubo de residuos; j. alcohol al 75%; k. pinzas; l. vidrio de 3-5 mm rosario. 4.1.2.2 Pasos de cultivo [El apéndice se explica en detalle en protocolo/modo SOP] Primero, inocular la cepa objetivo en medio LB y cultivarla durante la noche, diluir el líquido bacteriano según una determinada proporción con medio fresco y luego agregue el líquido bacteriano diluido. Transfiera al pocillo de una placa de 24 pocillos, agregue dos perlas de vidrio estériles e incube durante la noche a 37°C con agitación a 100 rpm. Tanto la cepa experimental como la cepa de control se inocularon y cultivaron de acuerdo con los procedimientos de cultivo del Apéndice Xa (Apéndice Xb), y luego se analizó la biopelícula (Capítulo 5). 4.1.2.3 Puntos técnicos a.Todas las operaciones deben cumplir estrictamente con los procedimientos operativos asépticos.Durante la operación, prestar atención al uso de equipos de esterilización y utilizar alcohol para desinfectar la mesa de operaciones y el equipo utilizado para evitar la contaminación cruzada; b. Antes de agregar el líquido bacteriano a la placa del pocillo, agite suavemente el depósito de líquido para mezclar el líquido bacteriano de manera uniforme y use una pipeta para canalizar suavemente el líquido bacteriano repetidamente para reducir los errores experimentales; c. No debe haber demasiado líquido bacteriano en el orificio para evitar salpicaduras de líquido bacteriano durante la agitación del cultivo, lo que causa contaminación cruzada; d. Cuando se utilizan pinzas estériles para transferir perlas de vidrio, es necesario minimizar la superficie de contacto entre las pinzas y las perlas de vidrio para garantizar la integridad. de la biopelícula; por ejemplo, cultivo de biopelícula en placa de orificio. Es necesario garantizar que el volumen del líquido bacteriano restante en los orificios después del cultivo sea básicamente el mismo. Durante el cultivo, la placa de pocillos debe sellarse con una película selladora transpirable para evitar que el líquido se evapore. 4.1.3 Ámbito de aplicación del método de cultivo en portaobjetos: El método de cultivo de biopelículas en portaobjetos suele ser adecuado para los siguientes escenarios: (1) Es necesario detectar la capacidad de formación de biopelículas entre diferentes cepas (cepas silvestres y cepas mutantes), ( 2) Es necesario detectar la sensibilidad/tolerancia de diferentes cepas a fármacos en estado de biopelícula. Los métodos de análisis para biopelículas cultivadas en portaobjetos incluyen principalmente: cuantificación de biopelículas (Capítulo 5.1.2c) y resistencia de biopelículas (Capítulo 5.3.2c). Los siguientes dispositivos y operaciones esquemáticos se ejemplifican utilizando Pseudomonas aeruginosa (PA) como cepa modelo en condiciones de cultivo aeróbico: Figura 3. Método de cultivo estático de biopelículas in vitro (método de cultivo en portaobjetos) 4.1.3.1 Materiales experimentales: a. Estéril placa de Petri (se requiere una placa de 6 pocillos para el cultivo estático); b. tubo de agitación estéril de 15 ml; c. medio de cultivo LB (se pueden usar otros medios de cultivo según sea necesario); d. ddH2O estéril (solución de PBS o solución salina fisiológica) se puede usar según sea necesario) e. Cepa bacteriana requerida; f. Balde de desechos; g. Alcohol al 75 %; h. Pinzas; i. Portaobjetos. 4.1.3.2 Pasos de cultivo [El apéndice se explica en detalle en protocolo/modo SOP] Primero, inocular la cepa objetivo en medio LB y cultivarla durante la noche, diluir el líquido bacteriano según una determinada proporción con medio fresco y luego agregue el líquido bacteriano diluido. Transfiera a una placa de Petri, agregue portaobjetos de vidrio estériles e incube durante la noche a 37°C con agitación a 100 rpm. Tanto las cepas experimentales como las cepas de control se inocularon y cultivaron de acuerdo con los procedimientos de cultivo del Apéndice Xa (Apéndice Xc), y luego se analizó la biopelícula (Capítulo 5). 4.1.3.3 Puntos técnicos a.Todas las operaciones deben cumplir estrictamente con los procedimientos operativos asépticos.Durante la operación, prestar atención al uso de equipos de esterilización y utilizar alcohol para desinfectar la mesa de operaciones y el equipo utilizado para evitar la contaminación cruzada; b. No debe haber demasiado líquido bacteriano en la placa de Petri para evitar la contaminación causada por salpicaduras del líquido bacteriano durante el cultivo en agitación; c. Cuando se utilizan pinzas estériles para transferir el portaobjetos, es necesario minimizar la superficie de contacto entre las pinzas y las perlas de vidrio para garantizar la integridad de la biopelícula; d. Durante el cultivo en agitación, la placa de cultivo debe sellarse con una película selladora transpirable para evitar la evaporación del líquido. 4.1.4 Ámbito de aplicación del método de cultivo con tapa de clavija: El método de cultivo de biopelícula con tapa de clavija suele ser adecuado para los siguientes escenarios: (1) Es necesario detectar la capacidad de formación de biopelículas entre diferentes cepas (cepas silvestres y cepas mutantes), (2) Es necesario detectar la sensibilidad/tolerancia de diferentes cepas a fármacos en estado de biopelícula. Los métodos de análisis para biopelículas cultivadas con tapa Peg incluyen principalmente: cuantificación de biopelículas (Capítulo 5.1.2c) y resistencia de biopelículas (Capítulo 5.3.2c). Los siguientes dispositivos y operaciones esquemáticos se realizan utilizando Pseudomonas aeruginosa (PA) como cepa modelo y en condiciones de cultivo aeróbico: Figura 4. Método de cultivo de biopelículas estáticas in vitro (método de cultivo de tapa con clavija) 4.1.4.1 Materiales experimentales: a. Placa de 96 pocillos; b. Tapa con clavija (consulte la Figura 3 del Apéndice); c. Depósito de líquido estéril; d. Pipeta de 100 μL; e. Tubo de agitación estéril de 15 ml; f. Punta de pipeta de 100 μL (o 1 ml); g. Medio LB (se pueden usar otros medios según sea necesario); h. Cepas requeridas; i. Barril de líquido residual; j. ;75% de alcohol; k. ddH2O estéril (se puede usar solución de PBS o solución salina fisiológica según sea necesario); l. Salmuera fisiológica estéril. 4.1.4.2 Pasos de cultivo [El apéndice se explica en detalle en protocolo/modo SOP] Primero, inocular la cepa objetivo en medio LB y cultivarla durante la noche, diluir el líquido bacteriano según una determinada proporción con medio fresco y luego agregue el líquido bacteriano diluido. Transfiera a una placa de 96 pocillos y luego cubra con cuidado la tapa de la clavija en la solución bacteriana. Incubar durante la noche a 37°C con agitación a 100 rpm. Tanto la cepa experimental como la cepa de control se inocularon y cultivaron de acuerdo con los procedimientos de cultivo del Apéndice Xa (Apéndice Xd), y luego se analizó la biopelícula (Capítulo 5). 4.1.4.3 Puntos técnicos a.Todas las operaciones deben cumplir estrictamente con los procedimientos operativos asépticos.Durante la operación, prestar atención al uso de equipos de esterilización y utilizar alcohol para desinfectar la mesa de operaciones y el equipo utilizado para evitar la contaminación cruzada; b. Antes de agregar el líquido bacteriano a la placa del pocillo, agite suavemente el depósito de líquido para mezclar el líquido bacteriano de manera uniforme y sople repetida y suavemente el líquido bacteriano con una pistola de volea para reducir los errores experimentales; c. No debe haber demasiado mucho líquido bacteriano en el orificio para evitar la contaminación causada por salpicaduras de líquido bacteriano durante el cultivo con tapa o agitación; d. Es necesario garantizar que el volumen de líquido bacteriano restante en los orificios después del cultivo sea básicamente el mismo, y el La placa de pocillos debe sellarse con una película selladora transpirable para evitar la evaporación del líquido durante el cultivo; por ejemplo, mover Al retirar el líquido residual y limpiar la biopelícula, tenga cuidado de no tocar la biopelícula para garantizar su integridad. 4.2 Cultivo dinámico de biopelículas in vitro Esta guía cubre dos métodos de cultivo de biopelículas estáticas in vitro comúnmente utilizados, incluido el método de cultivo en tubo y el método de cultivo en piscina. Los detalles son los siguientes: (1) El método de cultivo en tubo inyecta una solución bacteriana después de reposar y adherir en el tubo de silicona, el medio de cultivo se inyecta en el tubo de silicona a una velocidad constante, la biopelícula se cultiva en forma de flujo y la biopelícula se adhiere a la pared del tubo. Este método se utiliza generalmente en experimentos con una gran demanda de muestras de biopelículas, como recolección de muestras de biopelículas, recolección de exopolisacáridos y biotransformación, etc. Este método puede formar una gran cantidad de biopelícula. La estructura de la biopelícula es gruesa y el flujo es alto. Sin embargo, el tiempo de cultivo es largo y la operación es complicada. No es fácil observar la estructura de la biopelícula con un microscopio. (2) Método de cultivo en piscina: inyecte la solución bacteriana en el canal de la piscina de cultivo, déle la vuelta y déjela reposar hasta que las bacterias se adhieran a la cubierta, luego inyecte el medio de cultivo en el canal de cultivo a una velocidad constante y cultive. El biofilm se adhiere de forma fluida y se adhiere a la cubierta de la piscina de tres canales. Este método se utiliza generalmente en experimentos como la observación de la morfología de la biopelícula y los efectos de los medicamentos sobre la morfología de la biopelícula. Este método forma una morfología y estructura completa de la biopelícula. Puede combinarse con cepas marcadas con fluorescencia o diferentes métodos de tinción para observar directamente la morfología de la biopelícula bajo un microscopio con la misma estructura, pero el rendimiento es menor, la operación es compleja y el tiempo de cultivo es más largo. 4.2.1 Tubo-biopelícula Ámbito de aplicación: El método de cultivo de biopelícula en tubo suele ser adecuado para los siguientes escenarios: (1) Investigación que requiere simular el entorno de crecimiento de biopelícula en la tubería, (2) Se requiere una cantidad relativamente grande de biopelícula Investigación sobre muestras, (3) investigación relacionada sobre metabolismo (biotransformación) de fármacos/compuestos de biopelículas, etc. Los métodos de análisis para biopelículas cultivadas en tubos incluyen principalmente: análisis de peso seco/peso húmedo (Capítulo 5.4), extracción y secuenciación de genoma/transcriptoma/proteoma, observación por microscopía electrónica (Capítulo 5.7), sonda de oxígeno/detección de compuestos, monitoreo con aguja, etc. Los siguientes dispositivos y operaciones esquemáticos se ejemplifican utilizando Pseudomonas aeruginosa (PA) como cepa modelo y en condiciones de cultivo aeróbico: El método de cultivo de biopelículas tubulares tiene un alto rendimiento y puede cultivar muestras de biopelículas multicanal al mismo tiempo; este método puede producir una gran número de muestras de biopelícula a la vez y se usa comúnmente para análisis de peso seco/peso húmedo, extracción de muestras de genes, extracción de EPS y otros metabolitos, observación por microscopía electrónica y observación con sonda de oxígeno/sonda química. Figura 5. Método de cultivo dinámico de biopelículas in vitro (método de cultivo en tubo) 4.2.1.1 Materiales experimentales: a. Tubo de agitación estéril de 15 ml b. Longitud 50 cm, diámetro interior 1,0 mm Tubo de silicona (humedecido); c . Longitud 2520 cm, diámetro interior 1,0 mm Tubo de bomba de silicona (hidratado); d. Longitud 15 cm, diámetro interior 1,0 mm Tubo de gel de sílice (hidratante); e. Longitud 10 cm, diámetro interior 3,2 mm Tubo de silicona (humectante); Tubo de bomba (humedecido); g. Conector recto de igual diámetro (humedecido); h. Conector recto de diámetro variable (humedecido); i. Conector Luer (humedecido); j. Dos frascos de vidrio para cultivos de 2 litros; k. Medio LB al 10% (se pueden utilizar otros medios según demanda); l. Filtro (orificio de filtro de 0,22 μm); m. Bomba peristáltica (bomba aperistáltica, MasterFlex); n. Cepas requeridas; o. Contenedor para eliminación de objetos punzantes médicos; p. Alcohol al 75 %; q. Pinzas; r. Jeringas estériles de 5 ml y 1 ml; s . Aguja estéril; t. Pipeta; u. Pipeta estéril. 4.2.1.2 Pasos del cultivo [El apéndice explica en detalle en protocolo/modo SOP] Primero, esterilice el frasco de cultivo de vidrio, el tubo de silicona, el antiespumante y las pinzas que contienen el medio de cultivo a 121 °C durante 15 minutos, retire el tubo de silicona y, El antiespumante y las pinzas están secos y listos para usar. Como se muestra en la Figura 1, en la mesa de operaciones estéril, use el tubo de silicona b equipado con un conector de dos vías para conectar la botella de cultivo de vidrio que contiene el medio de cultivo, la bomba sin bloqueo, el filtro, los tubos de silicona c, d , e, f, y 2L de líquido residual en tanques en orden, al menos tres paralelos en el mismo dispositivo (uno paralelo se muestra en la figura) y coloque todo el sistema en una incubadora de temperatura constante. Inocular la cepa objetivo en un volumen apropiado de medio LB y cultivar durante la noche agitando a 200 rpm a la temperatura requerida. En la mesa de operaciones estéril, use medio de cultivo LB nuevo para diluir la solución bacteriana a OD600 nm = 0,1, use una aguja estéril para inhalar 2 ml de la solución bacteriana diluida e inyecte la solución bacteriana diluida en el dispositivo paralelo del tubo de silicona b. y sellarlo con silicona. Incubar estáticamente durante 2 horas para permitir que las células bacterianas se adhieran a la pared del tubo y luego incubar con medio de flujo LB al 10 % durante 3 a 7 días para establecer una biopelícula. Primero, esterilice y ensamble el dispositivo de cultivo tubular de biopelícula. Agregue una concentración de trabajo del antibiótico objetivo al frasco de vidrio de cultivo del grupo de medicamento y mezcle uniformemente; agregue un agente antibacteriano conocido al frasco de vidrio de cultivo del grupo de control positivo. a la concentración de biopelícula y mezclar uniformemente; agregar un volumen igual del disolvente antibiótico del grupo de medicación en el frasco de vidrio mediano del grupo de control negativo y mezclar uniformemente. El grupo de medicación, el grupo de control positivo y el grupo de control negativo se inocularon y cultivaron de acuerdo con los pasos de cultivo del Apéndice X (Apéndice Xe), y luego se recogieron las biopelículas para su observación. 4.2.1.3 Puntos técnicos a.Todas las operaciones deben cumplir estrictamente con los procedimientos operativos asépticos. Durante la operación, prestar atención al uso de equipos de esterilización y utilizar alcohol para desinfectar la mesa de operaciones y el equipo utilizado para evitar la contaminación cruzada; b . Use agujas Después de absorber el líquido bacteriano con la aguja, la aguja no debe mirar hacia el operador y la tapa de la aguja no debe volver a colocarse para evitar lesiones accidentales al operador; c. Deseche la jeringa y la aguja usadas en un recipiente médico. Contenedor de eliminación de objetos punzantes para eliminación unificada para evitar lesiones accidentales al operador; d. Asegúrese de que la bomba sin resistencia funcione a una velocidad constante para evitar la contaminación causada por el reflujo del líquido; e. Asegúrese de que el grosor del tubo de silicona pared es apropiada para causar la ruptura de la pared del tubo y afectar la formación de biopelícula; f. Si es necesario durante el proceso de cultivo, agregue Para el medio de cultivo, se debe usar alcohol para desinfectar la boca de la botella y las superficies adyacentes del dispositivo para evitar la contaminación; g La boca del frasco de cultivo debe sellarse con una película selladora transpirable para evitar que el medio de cultivo se evapore. 4.2.2 Método de cultivo en piscina (biopelícula de celda de flujo) Ámbito de aplicación: El método de cultivo de biopelícula en piscina suele ser adecuado para los siguientes escenarios: (1) investigación relacionada que requiere observación en tiempo real de la morfología de la biopelícula, (2) tiempo real observación de investigaciones biológicas relacionadas sobre la expresión y distribución de proteínas/genes marcadores en la biopelícula, (3) investigación que requiere observación en tiempo real de la posición relativa de diferentes especies bacterianas en la comunidad de biopelícula, etc. Los métodos de análisis para biopelículas cultivadas en piscinas incluyen principalmente: tinción de células bacterianas vivas y muertas (Capítulo 5.2), observación con microscopía de fluorescencia confocal láser (Capítulo 5.6), métodos cualitativos y cuantitativos de imágenes de fluorescencia 3D (Capítulo 5.5), etc. Los siguientes dispositivos y operaciones esquemáticos se basan en Pseudomonas aeruginosa (PA) como cepa modelo y se llevan a cabo en condiciones de cultivo aeróbico: El método de cultivo de biopelículas en piscina suele ser adecuado para los siguientes escenarios: (1) Figura 6. En Método de cultivo dinámico de biopelículas in vitro (método de cultivo en piscina) 4.2.2.1 Materiales experimentales: a. Tubo de agitación estéril de 15 ml b. Celda de flujo de tres canales y cubierta de resina c. cubreobjetos d. pegamento de silicona; e.Longitud 50 cm, diámetro interior del tubo de silicona de 1,0 mm; f. Longitud 25 cm, longitud 20 cm, diámetro interior del tubo de bomba de silicona de 1,0 mm, instalación de doble extremo; g .Longitud 15 cm, diámetro interior del tubo de silicona de 1,0 mm; h. Longitud 30 cm, diámetro interior del tubo de bomba de silicona de 1,0 mm; i. Conector recto de igual diámetro; j. Luer conector; k. Dos botellas de cultivo de vidrio de 2 L; l. Medio LB al 10% (se pueden utilizar otros medios según sea necesario); m. Filtro (orificio del filtro de 0,22 μm); n.  Bomba peristáltica (bomba aperistáltica); o. Cepa bacteriana requerida; p. Recipiente para eliminación de objetos punzantes médicos; q. 75 % de alcohol; r. Pinzas; s.5 mL y 1 mL jeringas estériles; t. agujas estériles; u. pipetas; tubo. 4.2.2.2 Pasos de cultivo [El apéndice se explica en detalle en protocolo/modo SOP] Primero, esterilice y ensamble el dispositivo de cultivo del tanque de biopelícula, agregue la concentración de trabajo del antibiótico objetivo al frasco de vidrio de cultivo del grupo de medicamentos y mezcle uniformemente; agregue colistina, que se sabe que tiene concentraciones antibacterianas e inhibidoras de biopelículas, en el frasco de vidrio de cultivo del grupo de control positivo y mezcle uniformemente; agregue un volumen igual del solvente antibiótico del grupo de medicamento en el frasco de vidrio de cultivo del grupo de control negativo y mezclar bien. El grupo de medicación, el grupo de control positivo y el grupo de control negativo se inocularon y cultivaron de acuerdo con los pasos de cultivo del Apéndice X (Apéndice Xf), y luego se recolectaron las biopelículas para su observación. 4.2.2.3 Puntos técnicos a.Todas las operaciones deben cumplir estrictamente con los procedimientos operativos asépticos.Durante la operación, prestar atención al uso de equipos de esterilización y utilizar alcohol para desinfectar la mesa de operaciones y el equipo utilizado para evitar la contaminación cruzada; b. Después de usar la jeringa y la aguja para absorber el líquido bacteriano, la aguja no debe estar orientada hacia el operador y la tapa de la aguja no debe volver a colocarse para evitar lesiones accidentales al operador; c. Deseche la jeringa usada y la aguja en un contenedor de eliminación de objetos punzantes médicos para su eliminación unificada y evitar lesiones accidentales. d. Asegúrese de que la bomba sin resistencia funcione a una velocidad constante para evitar la contaminación causada por el reflujo del líquido; e. Asegúrese de que el cultivo El tanque se voltea para evitar afectar la formación de biopelícula; f. Tenga cuidado al unir el tanque de cultivo y la tapa del tanque. La tapa del tanque está aplastada y el tanque de cultivo y la tapa del tanque deben estar completamente sellados para evitar la contaminación causada. por desbordamiento de líquido bacteriano y medio de cultivo; g. Asegúrese de que todos los canales del tanque de cultivo no estén obstruidos para evitar obstrucciones, causando reflujo de líquido y contaminación; h. Si es necesario agregar medio de cultivo durante el proceso de cultivo, alcohol debe usarse para desinfectar la boca del frasco y las superficies adyacentes del dispositivo para evitar la contaminación; i. La boca del frasco de cultivo debe sellarse con una película selladora transpirable para evitar que el medio de cultivo se evapore.

T/CI 011-2021 Historia

• 2023 T/CI 011-2023 Especificación técnica para la eliminación de subproductos de la desinfección en agua del grifo mediante nanofiltración.
• 2022 T/CI 011-2022 Estándares para probar y evaluar la capacidad profesional de los profesores de chino como lengua extranjera
• 2021 T/CI 011-2021 Lineamientos técnicos para el cultivo, observación y evaluación de la resistencia a medicamentos de biopelículas bacterianas.