ASTM F2944-20
Práctica estándar para ensayos automatizados de unidades formadoras de colonias (CFU): método de análisis y adquisición de imágenes para enumerar y caracterizar células y colonias en cultivo

Estándar No.

ASTM F2944-20

Fecha de publicación

2020

Organización

American Society for Testing and Materials (ASTM)

Ultima versión

ASTM F2944-20

Alcance

1.1 Esta práctica, siempre que se comprendan sus limitaciones, describe un procedimiento para la medición cuantitativa del número y las características biológicas de colonias derivadas de una población de células madre o progenitoras mediante análisis de imágenes. 1.2 Esta práctica se aplica en un laboratorio in vitro. 1.3 Esta práctica utiliza: (a) protocolos estandarizados para la captura de imágenes de células y colonias derivadas del procesamiento in vitro de una población definida de células iniciales en un campo de visión (FOV) definido, y (b) protocolos estandarizados para el procesamiento y análisis de imágenes . 1.4 El FOV relevante puede ser bidimensional o tridimensional, según el sistema de ensayo de UFC que se esté interrogando. 1.5 La unidad principal que se utilizará en el resultado del análisis es el número de colonias presentes en el FOV. Además, también se pueden evaluar las características y subclasificación de colonias y células individuales dentro del FOV, basándose en características morfológicas existentes, propiedades de distribución o propiedades obtenidas usando marcadores secundarios (por ejemplo, métodos de tinción o etiquetado). 1.6 Los métodos de obtención de imágenes requieren que las imágenes del FOV relevante se capturen con una resolución suficiente para permitir la detección y caracterización de células individuales y sobre un FOV que sea suficiente para detectar, discriminar y caracterizar colonias como objetos completos para evaluación. 1.7 Los procedimientos de procesamiento de imágenes aplicables a conjuntos de datos bidimensionales y tridimensionales se utilizan para identificar células o colonias como objetos discretos dentro del campo de visión. Los métodos de obtención de imágenes pueden optimizarse para múltiples tipos de células y características celulares usando herramientas analíticas para segmentación y agrupamiento para definir grupos de células relacionadas entre sí por proximidad o morfología de una manera que sea indicativa de una relación de linaje compartido (es decir, expansión clonal de una única célula madre fundadora o progenitora). 1.8 Las características de los objetos de colonias individuales (células por colonia, densidad celular, tamaño celular, distribución celular, heterogeneidad celular, genotipo o fenotipo celular y el patrón, distribución e intensidad de expresión de marcadores secundarios) son informativas de las diferencias en las propiedades biológicas subyacentes. de la descendencia clonal. 1.9 En condiciones experimentales adecuadamente controladas, las diferencias entre colonias pueden ser informativas sobre las propiedades biológicas y la heterogeneidad subyacente de las células fundadoras de colonias (UFC) dentro de una población inicial. 1.10 El área/volumen de células y colonias, el número, etc., pueden expresarse como una función del área del cultivo celular (milímetros cuadrados) o del volumen inicial de la suspensión celular (mililitros). 1.11 La obtención de imágenes secuenciales del FOV utilizando dos o más métodos ópticos puede ser valiosa para acumular información cuantitativa sobre células individuales u objetos de colonia en la muestra. Además, serán necesarias imágenes repetidas de la misma muestra en el contexto del seguimiento y validación del proceso. Por lo tanto, esta práctica requiere un medio de identificación reproducible de la ubicación de células y colonias (centroides) dentro del área/volumen FOV utilizando un sistema de coordenadas definido. 1.12 Para lograr un campo de visión (FOV) suficientemente grande, se pueden capturar imágenes de resolución suficiente como múltiples campos/mosaicos de imagen con gran aumento y luego combinarse para formar un mosaico que represente toda el área de cultivo celular. 1.13 Las células y tejidos comúnmente utilizados en ingeniería de tejidos, medicina regenerativa y terapia celular se ensayan y analizan de manera rutinaria para definir el número, la prevalencia, las características biológicas y el potencial biológico de las células madre originales y las poblaciones progenitoras. 1.13.1 Los tipos de células y fuentes de células aplicables comunes incluyen, entre otros: células madre y progenitoras de mamíferos; células derivadas de adultos (por ejemplo, sangre, médula ósea, piel, grasa, músculos, mucosas), células derivadas de fetos (para 1 Esta práctica está bajo la jurisdicción del Comité F04 de ASTM sobre Materiales y dispositivos médicos y quirúrgicos y es el responsabilidad directa del Subcomité F04.43 sobre construcciones diseñadas con células y tejidos para TEMP. Edición actual aprobada el 1 de abril de 2020. Publicado en junio de 2020. Aprobado originalmente en 2012. La última edición anterior fue aprobada en 2012 como F2944–12. DOI: 10.1520/F2944– 20. Copyright © ASTM International, 100 Barr Harbor Drive, PO Box C700, West Conshohocken, PA 19428-2959 Estados Unidos Esta norma internacional fue desarrollada de acuerdo con los principios internacionalmente reconocidos sobre estandarización establecidos en la Decisión sobre Principios para el Desarrollo de Normas Internacionales. Normas, guías y recomendaciones emitidas por el Comité de Obstáculos Técnicos al Comercio (OTC) de la Organización Mundial del Comercio (por ejemplo, sangre del cordón umbilical, placenta/cordón, líquido amniótico); células madre embrionarias (ESC) (es decir, derivadas de la masa celular interna de blastocistos); células pluripotentes inducidas (iPC) (por ejemplo, células adultas reprogramadas); cultivo de células expandidas; y células terminalmente diferenciadas de un tipo específico de tejido. 1.13.2 Los ejemplos comunes aplicables de fenotipos diferenciados maduros que son relevantes para la detección de diferenciación dentro y entre colonias clonales incluyen: fenotipos hematopoyéticos (eritrocitos, linfocitos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monocitos, macrófagos, etc.), específicos de tejido adulto fenotipos de células progenitoras (oteoblastos, condrocitos, adipocitos, etc.) y otros tejidos (hepatocitos, neuronas, células endoteliales, queratinocitos, islotes pancreáticos, etc.). 1.14 El número de células madre y células progenitoras en diversos tejidos se puede analizar in vitro liberando las células de los tejidos usando métodos que preserven la viabilidad y el potencial biológico de la población de células madre y/o progenitoras subyacentes, y colocando las células madre derivadas de tejido células en un ambiente in vitro que resulta en una activación y proliferación eficiente de células madre y progenitoras como colonias clonales. De este modo, el número real de células madre y progenitores (unidades formadoras de colonias verdaderas (tCFU)) se puede estimar sobre la base del número de unidades formadoras de colonias observadas (unidades formadoras de colonias observadas (oCFU)) que se han formado (1-3). 2 (figura A1.1). La prevalencia de células madre y/o progenitores se puede estimar en función del número de unidades formadoras de colonias (oUFC) observadas detectadas, dividido por el número total de células analizadas. 1.15 Se ha validado el método automatizado de adquisición y análisis de imágenes (descrito en el presente documento) para el recuento de células y colonias y se ha descubierto que proporciona exactitud y precisión superiores en comparación con el "estándar de oro" actual del recuento visual manual de células y colonias definido por el observador en un campo claro o microscopio fluorescente con o sin hemocitómetro (4), reduciendo la variación tanto intra como interobservador. Varios grupos han intentado automatizar este y/o procesos similares en el pasado (5, 6). Informes recientes demuestran además la capacidad de extraer datos cualitativos y cuantitativos de colonias de diversos tipos de células a nivel celular e incluso nuclear (4, 7). 1.16 Los avances en software y hardware ahora permiten en gran medida enfoques analíticos automatizados sistemáticos. Esta tecnología en evolución crea la necesidad de un acuerdo general sobre unidades de medida, nomenclatura, definiciones de procesos e interpretación analítica como se presenta en esta práctica. 1.17 Los métodos estandarizados para el análisis automatizado de UFC abren oportunidades para mejorar el valor y la utilidad de los ensayos de UFC en varios dominios científicos y comerciales: 1.17.1 Los métodos estandarizados para el análisis automatizado de UFC abren oportunidades para mejorar la especificidad de los métodos de análisis de UFC a través de la optimización de protocolos generalizables y métricas cuantitativas para tipos de células específicos y sistemas de ensayo de UFC que se pueden aplicar de manera uniforme entre laboratorios dispares. 1.17.2 Los métodos estandarizados para el análisis automatizado de UFC abren oportunidades para reducir el costo del análisis de colonias en todos los aspectos de las ciencias biológicas al aumentar el rendimiento y reducir las demandas del flujo de trabajo. 1.17.3 Los métodos estandarizados para el análisis automatizado de UFC abren oportunidades para mejorar la sensibilidad y especificidad de los sistemas experimentales que buscan detectar los efectos de las condiciones in vitro, estímulos biológicos, biomateriales y pasos de procesamiento in vitro sobre la unión, migración, proliferación, diferenciación y supervivencia de células madre y progenitores. 1.18 Las limitaciones se describen a continuación: 1.18.1 Identificación de colonias: fuente celular/tipo de colonia/variabilidad del marcador: las células madre y los progenitores de diversas fuentes de tejido y en diferentes ambientes in vitro manifestarán diferentes características biológicas. Por lo tanto, los medios específicos para detectar células o núcleos y los marcadores secundarios utilizados y la implementación de sus respectivos protocolos de tinción diferirán según el sistema de ensayo de UFC, los tipos de células y los marcadores que se estén interrogando. Los protocolos optimizados para la captura de imágenes y el análisis de imágenes para detectar células y colonias, definir objetos de colonias y caracterizar objetos de colonias variarán según la fuente de células que se utilice y el sistema CFU que se utilice. Estos protocolos requerirán optimización, caracterización y validación independientes en cada aplicación. Sin embargo, una vez definidos, estos pueden generalizarse entre laboratorios y en todos los dominios clínicos y de investigación. 1.18.2 Variabilidad inducida por instrumentación en la captura de imágenes: la elección de los componentes de adquisición de imágenes descritos anteriormente puede afectar negativamente la segmentación de células y la posterior identificación de colonias si no se abordan adecuadamente. Por ejemplo, el uso de una bombilla de mercurio en lugar de una fuente de luz fluorescente de fibra óptica o la desalineación general de la óptica podría producir una iluminación desigual o viñeteado de imágenes en mosaico que comprenden la imagen principal de campo de visión grande. Esto se puede corregir aplicando rutinas de resta de fondo a cada mosaico en una imagen FOV grande antes de unir los mosaicos. 1.18.3 Variación asociada al sistema de ensayo CFU en artefactos de imagen: además de la presentación de objetos de colonia con características únicas que deben utilizarse para definir la identificación de colonias, cada imagen de cada sistema CFU puede presentar artefactos que no son células ni colonias (por ejemplo, (por ejemplo, desechos celulares, pelusas, aberraciones del vidrio, reflejos, autofluorescencia, etc.) que pueden confundir la detección de células y colonias si no se identifican y manejan. 1.18.4 Métodos de captura de imágenes y variación del control de calidad: la variación en la calidad de la imagen afectará significativamente la precisión y reproducibilidad de los métodos de análisis de imágenes. La variación en el enfoque, la iluminación, el registro de mosaicos, el tiempo de exposición, el enfriamiento y la purga espectral de emisión son limitaciones o amenazas potenciales importantes para la calidad y reproducibilidad de la imagen. 2 Los números en negrita entre paréntesis se refieren a una lista de referencias al final de esta norma. F2944 − 20 2 1.19 Los valores indicados en unidades SI deben considerarse estándar. No se incluyen otras unidades de medida en esta norma. 1.20 Esta norma no pretende abordar todos los problemas de seguridad, si los hay, asociados con su uso. Es responsabilidad del usuario de esta norma establecer prácticas apropiadas de seguridad y salud y determinar la aplicabilidad de las limitaciones reglamentarias antes de su uso. 1.21 Esta norma internacional fue desarrollada de acuerdo con los principios internacionalmente reconocidos sobre estandarización establecidos en la Decisión sobre Principios para el Desarrollo de Normas, Guías y Recomendaciones Internacionales emitida por el Comité de Obstáculos Técnicos al Comercio (OTC) de la Organización Mundial del Comercio.

ASTM F2944-20 Documento de referencia

• ASTM F2998 Guía para utilizar microscopía de fluorescencia para cuantificar el área de extensión de células fijas*， 2023-10-29 Actualizar
• ASTM F3294 Guía estándar para realizar mediciones cuantitativas de la intensidad de la fluorescencia en ensayos celulares con microscopía de epifluorescencia de campo amplio
• ISO 20391-1 Biotecnología - Recuento de células - Parte 1: Orientación general sobre métodos de recuento de células
• ISO 20391-2 Biotecnología. Recuento de células. Parte 2: Diseño experimental y análisis estadístico para cuantificar el rendimiento del método de recuento.

ASTM F2944-20 Historia

• 2020 ASTM F2944-20 Práctica estándar para ensayos automatizados de unidades formadoras de colonias (CFU): método de análisis y adquisición de imágenes para enumerar y caracterizar células y colonias en cultivo
• 2012 ASTM F2944-12 Método de prueba estándar para ensayos automatizados de unidades formadoras de colonias (UFC); método de análisis y adquisición de imágenes para enumerar y caracterizar células y colonias en cultivo