ASTM F2997-13
Práctica estándar para la cuantificación de depósitos de calcio en cultivos osteogénicos de células progenitoras mediante análisis de imágenes fluorescentes

Estándar No.

ASTM F2997-13

Fecha de publicación

2013

Organización

American Society for Testing and Materials (ASTM)

Estado

Remplazado por

ASTM F2997-21

Ultima versión

ASTM F2997-21

Alcance

5.1 Los ensayos de diferenciación de osteoblastos in vitro son un enfoque para detectar células madre progenitoras en busca de su capacidad para convertirse en osteoblastos. La extensión de los depósitos calcificados o de la matriz mineralizada que se forman in vitro puede ser un indicador de diferenciación hacia un osteoblasto funcional; sin embargo, la expresión genética de genes o proteínas osteogénicas es otra medida importante que se puede utilizar junto con este ensayo para determinar la presencia de un osteoblasto. 5.2 Este método de prueba proporciona una técnica para teñir, obtener imágenes y cuantificar la intensidad de fluorescencia y el área relacionada con la mineralización en cultivos de células vivas utilizando el colorante quelante de calcio no tóxico, naranja de xilenol. El área teñida positivamente de depósitos mineralizados en cultivos celulares es una medida indirecta del contenido de calcio. Es importante medir la intensidad para asegurar que las imágenes no hayan sido subexpuestas ni sobreexpuestas. La intensidad no se correlaciona directamente con el contenido de calcio ni con el área. 5.3 Xylenol orange permite el seguimiento de depósitos calcificados repetidamente a lo largo de la vida del cultivo sin detrimento del cultivo. No hay interferencia en mediciones posteriores del área mineralizada debido a la acumulación de tinte debido a la aplicación repetida (1).3 Los depósitos calcificados que han sido teñidos previamente pueden parecer más brillantes, pero esto no afecta la medición del área. Los colorantes de calceína también se pueden usar para este propósito (1), pero requieren un procedimiento de análisis diferente al del naranja de xilenol (es decir, concentración y juegos de filtros) y, por lo tanto, no se incluyen aquí. Alizarin Red y Von Kossa no son adecuados para su uso con este procedimiento en cultivos vivos ya que no existe documentación que respalde su uso repetido en cultivos vivos sin efectos nocivos. 5.4 El método de prueba puede aplicarse a cultivos de cualquier célula capaz de producir depósitos calcificados. También se puede utilizar para documentar la ausencia de minerales en cultivos donde el objetivo es evitar la mineralización. 5.5 Durante los ensayos de diferenciación de osteoblastos, se proporcionan suplementos osteogénicos para inducir o ayudar con el proceso de diferenciación. Si se utilizan suplementos osteogénicos en exceso, puede producirse un depósito calcificado en los cultivos celulares que no está mediado por osteoblastos y, por lo tanto, se denomina distrófico, patológico o artefacto (2). Por ejemplo, cuando se utilizan concentraciones más altas de beta-glicerofosfato en el medio para que funcione como sustrato de la enzima fosfatasa alcalina secretada por las células, hay un marcado aumento del fosfato libre, que luego precipita con iones Ca++ en el medio para formar cristales de fosfato cálcico independientemente del estado de diferenciación de la célula progenitora. La producción de fosfatasa alcalina está asociada con la diferenciación de las células progenitoras y frecuentemente es estimulada por la adición de dexametasona al medio, lo que mejora la formación de depósitos calcificados. Por lo tanto, este tipo de depósitos calcificados/minerales se consideran distróficos, patológicos o artefactos porque no fueron iniciados por un osteoblasto maduro. Por lo tanto, la medición obtenida mediante esta práctica puede dar como resultado una interpretación potencialmente falsa del estado de diferenciación de las células osteoprogenitoras si se usa de forma aislada sin datos de expresión de genes o proteínas (3,4). 5.6x00a.............

ASTM F2997-13 Documento de referencia

• ASTM F2312 Terminología estándar relacionada con productos médicos diseñados con tejidos
• ASTM F2603 Guía estándar para interpretar imágenes de andamios de tejido polimérico
• ASTM F2739 Guía estándar para cuantificar la viabilidad celular y atributos relacionados dentro de estructuras de biomateriales

ASTM F2997-13 Historia

• 2021 ASTM F2997-21 Práctica estándar para la cuantificación de depósitos de calcio en cultivos osteogénicos de células progenitoras mediante análisis de imágenes fluorescentes
• 2013 ASTM F2997-13 Práctica estándar para la cuantificación de depósitos de calcio en cultivos osteogénicos de células progenitoras mediante análisis de imágenes fluorescentes